未来实验室：模块化流动平台，带有多个集成 PAT 工具，用于多步反应

背景介绍

近年来，反应数据采集、处理和控制的新兴技术已开始将制药过程开发转变为数据日益丰富的科学领域。制药商已开始采用“工业 4.0”的精神，其中模拟、系统集成和大型数据集的生成是更加关注质量、安全、成本效益和可持续性的关键推动因素。充分利用这些技术进步有望在开发和执行化学工艺的速度和可靠性方面取得显着改善。制药监管机构最近发起的质量源于设计 (QbD) 计划鼓励制造商基于对反应的透彻理解来设计和控制流程。这一举措的关键是通过过程分析技术 (PAT) 实时采集化学过程开发和过程中监控的数据。

当前，制药行业的范式正在从传统的批量生产转向用于制备活性药物成分 (API) 的连续加工，这得到了 PAT 可用性和实施的增加的支持。最近的审查强调了 PAT 在连续流环境中的成功实施。PAT 已在连续流系统中用于实现过程控制的反馈回路，黑盒优化，如实验设计 (DoE) 和自动自我优化，动力学模型鉴别和参数估计，并指导药物发现程序.最常用的实时在线 PAT 工具是 UV/Vis、Raman、IR、和NMR。最近，它们的使用变得越来越流行，部分原因是台式设备和流通池的商业可用性增加。此外，还描述了在连续流动平台内使用集成色谱分析技术，例如高效/超高效液相色谱 (HPLC/UPLC) 和 GC。然而，在这些情况下，通常需要在进样前进行额外的样品制备。在学术和工业实验室中，离线执行所有这些分析技术仍然很常见。在这些情况下，样品制备会浪费时间，并且分析的样品并不总是代表反应性能。与仅使用离线分析的情况相比，利用实时分析的流程将导致更快且通常更可靠的流程优化。

上述示例表明，在连续流系统中集成单个分析仪器以分析单步反应现在在连续处理社区中已经很好地建立起来。然而，流动化学的一个关键优势是能够在集成的连续流动系统中执行复杂的多步骤转换，而无需人工干预。目前，在不中断的情况下将不同的反应器模块和分析组合成一个完全集成的连续过程的先例有限。连续流技术通常不灵活，不同步骤之间会出现兼容性问题。使用不同技术在连续流系统内的多个点进行反应分析对于快速参数优化和有效控制过程性能以完全实现多步转换至关重要。现有的多步连续流转换研究通常在分离的连续流步骤中使用不同的 PAT 仪器。

精心设计的连续流反应器已被证明可以显着提高各种系统的反应性能；特别是那些对混合敏感、高度放热或涉及短期中间体的产品。因此，由多个离散单元组成的模块化反应器系统最适合这些应用，因为每个“模块”都可以优化以适应所需的化学反应并重新配置以适应无数不同的反应系统。

由于其增强的传热和传质特性，在微反应器系统中使用有机金属试剂进行的反应可以观察到显着改进，但有机金属试剂可能会由于反应器通道内的水分敏感性和固体形成而带来重大的处理挑战。在间歇式反应器中，这种类型的反应通常在低温下进行，但流动处理可以承受更高的温度。我们目前的研究兴趣使我们研究了多个 PAT 仪器（IR、NMR 和 UPLC）在模块化流动反应器系统中的集成，以监测具有挑战性的多步有机金属转化。

2019年4月08日，欧洲著名连续流专家C. Oliver Kappe教授研究小组的一项成果发表在Reaction Chemistry & Engineering期刊上（DOI: 10.1039 / C9RE00087A ）。该文章（Laboratory of the future: a modular flow platform with multiple integrated PAT tools for multistep reactions）以在线分析与连续流化学相结合，构建了有利于工业4.0的未来实验室如图1b所示，并以化合物丙酸叔丁酯在该体系下合成β-羟基丁酸酯类产物为例进行了说明。如图1a所示。

图1.  a）反应方案显示丙酸叔丁酯1的去质子化，其与醛亲电子试剂3的反应，然后骤冷，得到醛醇产物5；b）本研究中使用的zui终反应装置示意图，显示泵，传感器（T =温度传感器; P =压力传感器）和PAT仪器的位置，以及它们与LabVision控制系统的连接（黑色虚线=电信号连接线，蓝色虚线=循环换热介质路线）。

结果与讨论：

第一步是通过用二异丙基氨基锂（LDA）去质子化丙酸叔丁酯1来生成烯醇化物2（图1a）。然后烯醇化物2与4-氟苯jia醛3反应生成金属化的中间体4. 随后用水原位淬灭得到所需产物5. 这类化学物质广泛用于靶向合成相关药物。

整个系统包括连续流反应器，四个进料泵，进料溶液包括：

1. 0.4M底物1和内标（联苯）在THF中的溶液

2. 0.44M LDA在THF中的溶液

3. 0.48M 4-氟苯甲醛3在THF中的溶液，

4. 水

首先将基质1和LDA溶液混合以在1#反应片中形成烯醇化物2，停留时间为约5秒。随后，将醛3溶液引入2#反应片中，在骤冷之前再反应80秒。骤冷的停留时间相当于约18秒。

将来自1#反应模块的流出物通过IR流通池进行在线IR分析。然后使反应混合物通过在线流动池（0.8mL内部体积），用台式NMR光谱仪（Spinsolve Ultra 43MHz，Magritek）监测。然后引入水以淬灭反应混合物并收集出口混合物。在引入水之后在线进行UPLC分析并通过对分馏的反应器输出进行取样来离线。在在线分析的情况下，将工艺流出的样品转移，然后用H2O / MeCN稀释。

随后，将6号通阀（2.6μL注射体积）注入等分试样的稀释流到LC柱上。连续流量设置中的泵和传感器连接到HiTec Zang LabManager单元，并由LabVision软件控制。

结果得到图2，IR分析图，图3，NMR，图4，UPLC分析图，可以在反应的不同阶段通过仪器实时监测反应及时观察到过程的化学反应和生产。

图2. 代表性的ReactIR光谱  a）丙酸叔丁酯原料1及其去质子化形成烯醇化物2; b）丙酸叔丁酯1和醛亲电子试剂3的组合溶液。

图3. 反应混合物的堆叠NMR光谱

显示醛3转化为产物烯醇化物4的程度。使用配备有玻璃流通池的Magritek Spinsolve Ultra 43MHz获得这些光谱。

图4. 代表性的UPLC色谱图显示了所有测量的反应组分

标记为“极性物质”的信号主要由4-氟苯甲酸组成，在醛3中作为次要杂质存在。并根据已有数据进行进一步分析得到图5与图6，对多步反应判断更加准确。

图 5 用于在线 UPLC 分析的连续二次采样和稀释设置的示意图，通过自动进样。

UPLC 的更高灵敏度意味着与传统 HPLC 方法相比，它还能耐受低得多的分析物浓度。

压力和泵送稳定性

在反应器系统运行较长时间后，由于试剂输送不一致而导致挫折，因此红外迹线显示脉冲允许保留高达 50% 的丙酸起始材料。当用压力曲线交叉检查 IR 数据时，发现这个时间与泵注射器互换相匹配。泵性能由科里奥利质量流量控制器测量，以允许对泵参数进行微调。在每个单独的泵的情况下，发现理想值是不同的，但是一旦校正就提供无脉动操作。

此外，对操作期间获取的压力读数的分析显示出不稳定的曲线，在某些情况下，由于部分通道堵塞，观察到压力增加了 20bar以上。我们认为堵塞是由锂盐沉淀引起的。在大多数情况下，一段时间后，由此产生的压力增加会解除堵塞，使系统压力恢复到正常水平。然而，部分堵塞不利于长期反应稳定性，加速泵磨损，而且限制试剂流动和抑制混合。最终，将发生完全阻塞并需要临时关闭该过程。在制造环境中，这种类型的故障可能需要将大量材料转移到废物中（尤其是在流程重启阶段），从而导致供应链复杂化和资金损失。

对于所有后续实验，安装了具有更宽通道（最小直径为 0.5 毫米）和更大体积（1.63 毫升）的反应器板。在该反应器配置中，去质子化的停留时间变为大约 11 秒，并且在淬灭之前添加亲电试剂后还有 99 秒。骤冷的停留时间约为 18 秒。使用这个新的反应器板，没有观察到进一步的堵塞问题，从而产生稳定的压力分布。

反应优化实验

结合所有三种 PAT 仪器，预计大量数据将能够在短时间内优化反应参数。这是作为一次一个因素开始的研究，检查反应温度（0–40 °C）、醛3负载（1–1.2 当量）和 LDA 负载（1–1.2 当量）的影响.

发现该过程在 20 °C 下运行最有利。预计升温至 40 °C 会提高锂盐的溶解度并降低沉淀的可能性，但会对产物5 的形成产生不利影响。当考虑到工业规模时，在接近环境温度下进行通常需要分批低温条件的有机金属反应已被证明具有节省大量能源的潜力。

随后，使用统计实验设计软件包（Modde v11）将优化实验的响应拟合到多项式模型中。通过使用多元线性回归，根据醛3和所需产物5的 NMR 和 UPLC 数据拟合模型。通过包括所有主要、平方和交互项然后删除不重要的项来生成模型。R 2值为0.74（3，NMR），0.89（3，UPLC），0.93（5，NMR）和0.84（5，UPLC）的所有模型都实现了良好的拟合。这些模型还显示出中等至良好的可预测性水平Q 2值为0.50（3，NMR）、0.79（3，UPLC）、0.66（5，NMR）和0.66（5，UPLC）。已证明醛3当量在探索的当量范围内对所需产物5 的产率没有影响。增加LDA当量显示出对产物5产率具有积极影响。观察到温度影响的负平方项，描述了从 0 到 20 °C 的产量增加5和从 20 到 40 °C 的下降。基于使用 UPLC 数据。这些模型随后用于探索实验设计空间（图 6）。

图 6 使用离线 UPLC 分析的实验数据拟合的模型预测产品产量的等高线图。

图7、横向扩展运行的反应数据  a）总体反应方案，突出显示量化的物种; b）图表显示了不同仪器检测到的每个物种随时间的数量。

在几乎整个反应期间观察到酯1的完全去质子化，这意味着试剂递送与任何流速变化的可忽略的影响一致（图7b，红线）。当观察到两次短暂的干扰时（29和32分钟），酯1去质子化程度降低5％导致产率降低10％，持续约10分钟。由这种微小偏差引起的这种显着影响强调了该过程对微小变化的敏感性，以及实时反应监测的能力。

UPLC分析显示在整个实验期间所需产物5的产率为70-85％（图6b，绿线），与来自先前产生的多项式模型的预测值相对应。然而，NMR监测提供了85-90％的前驱物4的始终较高的值。这种差异被认为是由于通过NMR在所需中间体4与副产物6之间的差的差异引起的。

这种副产物来自于将产物烯醇化物4加入到第二个亲电试剂分子中（ESI第4.2节），并且其在整个反应过程中的增加与醛3的减少相对应。这突出了UPLC作为定量分析技术的能力，它在众多化学物种之间的分辨率尽管绝对值存在差异，但两种技术观察到的趋势基本相同，从而进一步为获得的数据提供了信心。

按比例缩小的连续流动过程在70分钟的时间内成功运行，通过柱色谱法纯化后分离出4.9g所需产物，相当于产率为70％，产率为4.2g h-1。

实验结论

本研究已经证明了三种不同的在线分析仪器在模块化反应器系统中的集成，可用于多步有机金属反应的优化和过程监测。该模块化流动反应器可通过多个传感器和集成控制系统实现实时反应监测。

使用在线React IR监测LDA对丙酸叔丁酯1的去质子化，其中可以清楚地量化酯C = O拉伸的消失。随后，使用醛质子和芳基质子作为不同的标记，通过在线NMR监测烯醇锂加入到亲电子试剂3中的进程。zui终的反应性能通过在线UPLC量化，通过定制的连续二次取样稀释系统实现。

利用大量数据快速探索反应参数，绘制实验空间。对于生成的所有多项式模型，获得了良好的拟合，允许估计每个参数的小变化将对总体反应性能产生的影响。使用集成传感器和在线分析来监控每个反应步骤，从而扩大了流程。开发的具有集成PAT的反应器平台支持数据丰富的实验室环境，用于实时多步反应监测; 对于制药和精细化工行业实现工业4.0以及未来实验室至关重要。