生物催化在连续流动中的兴起

流动化学在各种领域都有应用，并且具有改进许多化学过程的潜力。在过去的 15 年中，随着商用设备的发展以及学术文献的增加和工业界的采用，这些使能技术在研究和开发应用中的使用迅速增加。

连续流生物催化领域正迅速成为化学家关注的关键领域，其应用领域包括精细化学品、药物、生物治疗剂和生物燃料等。这反映在现代实验室中流动技术的采用以及工业和学术界对这些技术的更多了解上。连续流动生物催化的使用在过去几年中显着增加的出版物数量中得到了证明。

为什么要进行连续流生物催化？

在传统的生物催化系统中，间歇搅拌釜反应器是最常见的方法，这是最广泛使用的反应器类型。然而，该方法具有相对较低的体积生产率并且酶与搅拌器和叶轮的碰撞导致酶的降解和磨损。在间歇反应中使用游离酶会受到生物催化剂循环和回收的限制。

流动化学可以提供很多东西，并显示出与传统方法相比的几个优势。该方法具有提高生物转化率的潜力，因为它增加了传质，通过减少反应时间和增加材料产量使其使用更经济。酶的固定化可提高稳定性，减少产品纯化，更好地控制底物接触时间，其可回收性降低成本并扩展其生产适用性。

作为一项既绿色又可持续的技术，学术界和工业界现在正专注于持续生产。微型流动反应器用于连续处理，因在密闭空间中严格控制的条件下进行反应。生物催化采用小型化流动反应器中运行的连续流动技术优点：

1.减少环境影响、改善传热和传质以及高能效；

2.通过延长反应时间或构建串联和/或并联反应器来轻松增加容量；

3.降低与危险中间体积累和储存相关的风险，因为它们的瞬时量低于安全限制； 4.与在搅拌条件下使用固定化酶相比，减少了酶活性的磨损；

5.反应参数（温度、压力、流速）设置和监测导致更可靠和可重复的过程。

全细胞与纯化蛋白

有两种一般类型的生物催化，全细胞和纯化的蛋白质生物催化。全细胞催化使用整个生物体，例如大肠杆菌（E.coli）进行转化，而纯化的蛋白质生物催化使用提取的蛋白质而没有细胞存在。

全细胞生物催化依赖进出细胞的底物进行转化。全细胞催化有两种方法：发酵和生物催化。化学家感兴趣的是生物催化。全细胞生物催化的优点是它比使用纯化的蛋白质便宜，缺点是细胞膜限制了底物和产物的渗透，使反应比纯化的蛋白质更慢，

然而，纯化酶的优势在于其转化具有特异性，但这使得酶通常对底物具有相当的特异性。当使用纯化的酶时，底物只需要扩散到蛋白质的活性位点，而不是穿过细胞膜。此外，与全细胞相比，与相同质量相比，所需酶的浓度更高。然而，纯化过程可能很昂贵，有时这些纯化的蛋白质在细胞结构之外可能不稳定。

虽然两种类型的生物催化都用于连续流动系统，但固定化酶的使用在该应用中显示出最大的优势。

固定化酶

有多种固定酶的方法，理想情况下，它们应显示相同的特性。大多数有几个，包括；

· 大表面积

· 化学和热稳定性

· 适合（且足够）用于连接的官能团

·易于再生

· 不溶于水

· 刚性和机械强度

· 低成本

· 最基本的固定技术是截留、吸附、共价、亲和、交联和封装，如下所示。

生物催化剂在固体载体（或载体）上的吸附依赖于蛋白质或细胞与固定载体之间的疏水、盐桥、范德华力和氢键相互作用。吸附更容易进行，并且可以通过对蛋白质的最小变形来避免酶变性。然而，固定寿命和效率可能低于可比较的共价固定。

在共价结合（covalence）的情况下，支撑材料被活性基团（例如胺、环氧基等）官能化，并且酶通过它们与表面共价结合。共价固定的主要好处是由于减少了浸出而有可能提高催化剂寿命。

亲和固定围绕在不同条件下对固定支持物具有不同亲和性的酶展开。

通过与固定载体的共价或非共价相互作用将生物催化剂捕获到笼状网络中来实现捕获固定。其中一种方法是直接固定在微通道壁上。另一种方法利用酶固定在微通道内的固体支持物上，例如在微米和纳米粒子、多孔聚合物整料或膜上。

酶级联

连续流动化学对酶催化级联反应产生了令人印象深刻的影响，为生物合成和生物分析应用打开了新的潜在途径。生物催化级联反应是模仿自然活动和合成途径的原子经济和节能过程。在连续运行的流通系统中级联反应的性能包括进一步的积极特性，例如改进的传质和传热以及更好的反应物混合，例如提高反应速率和使生物催化剂由于缺乏高剪切应力。此外，生物催化剂的活性增加，例如通过精确控制与反应器体积相关的停留时间来避免底物和产物抑制。通过将此策略与实时监控相结合，可以实现进一步的决定性优势，从而不仅可以更好地了解整个过程，还可以更好地了解构成级联的各个步骤。

连续运行的流动系统中的多酶级联可以显着提高所考虑的生物催化过程的效率和生产力。最近，Lauterbach 及其同事将亚胺还原酶与二胺氧化酶结合，并将这些酶固定在聚合物涂层的玻璃多孔载体上。酶促级联在连续流动反应器中进行，H 2和O 2均通过电解产生并通过透气膜转移到流动系统中。酶促级联建模使我们能够了解参数的影响并在运行级联以进行连续合成时对其进行优化。芬尼根等人。结合机械和经验建模来优化用于连续还原胺化的双酶系统。与传统的一次一个因素（OFAT）方法相比，多维优化显示出明显的优势。此外，这些模型的可用性可以通过 github 等现代公共平台进行扩展，并且可以使用基于云的 Python notebook 进行操作。在我们看来，这些在硅方法是流通式生物技术的重要突破性发展。由于研发 (R&D) 部门的成本较低，因此节省的时间有助于工业规模的酶促反应的突破。有这些模型工作的电脑，需要基本的实验验证动力学数据。

实时监控在连续流动模式下操作的化学过程的优点是集成、快速且易于执行实时分析、优化和放大。事实上，可以通过实时监控评估多个参数并获得即时反馈。这种称为“过程分析技术”(PAT) 的策略可以轻松确定因果关系以及每个变量如何影响过程。实时监测所需的所有设备，例如样品稀释器、溶剂交换和去除装置，都可以放置在采样和分析之间。今天，有多种用于流量设备的分析技术、工具和传感器可用且适用。其中，在线高效液相色谱（HPLC）是应用最广泛的分析方法之一，其通用性强，实施时间短，易于理解。其他经常使用的监测技术是实时气相色谱 (GC) 和质谱 (MS)。此外，内联红外 (IR) 和衰减全反射傅里叶变换红外 (ATR-FTIR) 光谱也得到了广泛应用。幸运的是，这种光谱技术允许在反应过程中跟踪受关注的反应物和产物的浓度变化，并且有利地观察一些否则无法检测到的中间体的形成。最近一个有趣的实时应用程序使用了一种在化学实践中早已建立的方法：核磁共振 (NMR)。这种非常强大的非破坏性和定量分析策略被用作实时监测仪器，称为“台式核磁共振”单元，特别有用。重要信息，尤其是在生物事件中，例如使用该光谱可以轻松获取蛋白质折叠、代谢途径、翻译后蛋白质修饰和酶活性。台式核磁共振能够以流动模式运行实验，它基于永磁体的存在，其主要优点是占地面积小、几乎零维护和易于操作。通常，它在制备色谱中用作在线检测器，允许以简单快速的方式监测和量化物质。

流动辅助合成技术（FAST）作为工业装置：FAST系统由 Rahman等人提出。作者成功地使用 FAST 加氢连续平台在低压 H 2水溶液中进行更环保的芳族硝基还原反应。（生物）催化界将进一步见证学术界和工业界的发展，以加快化学品生产的研究和技术实施阶段。

连续流自优化平台 如今，工业过程基于连续的生产过程以及将生产与物流联系起来的持续数字化。这个“工业 4.0”领域的特点是数据收集、数据存储和机器学习算法。新视角可以与连续流动化学完美结合，促进对反应时间、温度和成分的卓越控制，这些一直是流动过程的基石。最近的技术导致了具有集成智能算法的自动化平台的开发，这些算法能够控制优化过程并最大限度地减少所需的人工注意力。从长远来看，这种策略将使更快、更轻松地实现理想过程并避免人为偏见成为可能。与自动自优化平台相关的主要缺点是它们在开发时考虑了单一和特定的过程。不幸的是，直到现在，通过组装来自不同制造商的设备和工具来设计一个通用的、全自动的系统仍然是一个挑战，因为在大多数情况下，它们将使用不平等和不兼容的通信方法。在此基础上，现在的注意力集中在如何从软件角度开发模块化或即插即用系统，从而实现更好的设备控制和不同硬件组件的集成以实现过程强化。希望在从过去的数据和错误中学习以指导实验的算法的宝贵帮助下，连续流动过程将很快实现。

下游处理

通常连续生物催化的主要焦点集中在流动系统本身的开发和改进上。我们认为，到目前为止，下游处理 (DSP) 并未受到同等程度的关注，尽管在开发连续流动化学的同时，连续 DSP 也获得了一些关注。此处的开发目标主要是提高工艺效率、提高产品产量和质量并降低空间要求和商品成本。这种新方法已应用于纯化最终产品的生物制药。连续方法可以使用各种技术和工具进行，例如连续离心、深度过滤或切向流过滤 (TFF)，代表制造规模的初级澄清技术。关于生物大分子的分离和纯化，可以参考 Vicente等人最近发表的教程评论。

然而，迄今为止最常用的连续DSP技术是连续色谱法。连续色谱受益于两个主要优点：首先，处理量减少，其次，对不稳定化合物的耐受性更强。因此，连续流动操作可以在更小的柱子内改进更多的纯化循环，同时利用更短的处理时间，这是纯化不太稳定的蛋白质时的主要优势。

通常，原位固相吸附可用于连续流动生物催化。虽然现在文献中已经适度使用了各种吸附材料，但研究领域仍然缺乏对大量市售吸附材料（和离子交换树脂）的系统筛选。最近，von Langermann 及其同事提出了两项研究，在摇瓶实验中生物催化反应产物的 DSP 方面取得了有希望的结果，这些研究可以转移到酶促连续过程中的应用。此外，原位产品回收技术 (ISPR)，如原位产品结晶 (ISPC)和原位产物吸附 (ISPA) 有助于实现连续 DSP。

非常规媒介

生物催化和绿色化学改变了我们进行化学合成的方式，尤其是在工业规模上。一方面，它们为研究领域带来了诸多优势，但另一方面，它们也引发了许多新的问题和疑虑。在酶促过程中，大多数生物催化剂在达到其最大活性的水性反应条件下运行最佳。相比之下，疏水性底物通常几乎不溶于水环境，应用化学家的行动自由受到严重限制。

为了克服这些问题，有机溶剂中酶催化的子领域很早就形成了。1980 年代至 90 年代，该领域的先驱记录了酶在非水介质中的使用：Klibanov、Halling、Mattiasson 和 Adlercreutz。此外，在 2000 年代初，发表了关于离子液体 (IL) 中生物催化反应的第一篇论文。

最近，Wang 和同事研究了 16 种不同的离子液体作为微流体生物催化的助溶剂。作者使用了一种新型重组 RhaB1 酶（一种属于糖苷水解酶家族 78 (GH78)的细菌 α- 1-鼠李糖苷酶）。没有任何进一步的纯化步骤，芦丁水解产生异槲皮苷。使用连续流动的玻璃-PDMS 微通道反应器和胶体酶的水溶液，4 小时后重组 RhaB1 在微通道中聚集并堵塞通道。当 IL [Toma][Tf 2N]同时作为助溶剂，增加了RhaB1的溶解度和流动性，不发生团聚，微通道不堵塞。此外，作者证实了使用 IL 对 RhaB1 活性的积极影响。在最佳条件下，异槲皮苷产量约为。使用微通道反应器在 10 分钟内达到 99%。通过这项研究，作者能够证明微反应器的缺点可以通过系统和智能地使用 IL 等助溶剂来克服。

Grollmisch等人的工作。最近证明了脂肪酶 CalB 在聚合离子液体 (PIL) 中的固定化，即使该材料尚未用于连续系统，也应在此处提及，但它无疑指明了前进的方向。此外，Villa等人。使用微流系统讨论生物催化和 ISPR 中的非常规介质。

“非常规介质中的生物催化”（BNCM）的主题最近因使用深共熔溶剂（DES）作为生物催化中的有效溶剂和反应（共）介质而得到加强。DESs在过去几年中受到广泛关注，它是一种新型溶剂，具有特殊的优点，例如简单快速的制备过程和多种可调性能。通过混合路易斯或布朗斯台德酸和含有多种阴离子和/或阳离子物质的碱获得低共熔混合物。然而，与离子液体相比，最终溶剂具有较低的内在毒性，使其成为有前途的替代品。它的主要缺点是高粘度（取决于起始材料）是工艺放大的一个问题，但可以通过将它们与其他（共）溶剂混合来轻松克服。在这种情况下，添加水/缓冲液（例如高达 20% v/v）已显示粘度显着降低。所有这些特性使 DES 特别适用于连续流动化学，其量身定制的特性使多级连续流动过程和级联反应成为理想的选择。

连续流光生物催化

使用光催化是一种优雅的方法，在科学界引起了极大的关注。如今，与不依赖光的替代品相比，光催化已被证明可以在更温和的条件下使用（过渡）金属或有机催化剂来扩展底物范围。在此，光催化反应利用光催化剂在其激发态时增强的反应性，例如允许与有机底物的单电子转移（SET）过程，产生在有机合成中起关键作用的自由基。

越来越多的研究集中在光生物催化反应上，包括与光催化剂偶联的酶以及严格依赖光的光酶只能在光照下催化反应最近，Schmermund等人和 Park 及其同事回顾了这个不断发展的光生物催化研究领域。事实上，如今光驱动的酶促生物催化得到了广泛的研究并且——在我们看来——光生物催化和连续流动化学的整合和整合似乎是拓宽这一有趣研究领域知识的下一个合乎逻辑的步骤。例如，连续流技术可以克服低光穿透深度和反应介质内光分布的不均匀性。结合两个研究部分的优点（和缺点）可以导致更有效的催化时代，我们假设概念验证示例将在不久的将来发表。

结论与展望

生物催化和流动化学的融合正在进行并且正在增加。这是有道理的：高表面积与体积比、改进的混合和传质、卓越的温度控制和小体积需要显着减少的试剂量和更短的从构思到应用的时间。所有这些有利的参数都将促进和激发研究。与经典的“烧杯生物催化”相比，流动化学可以更加高效、资源高效、可控且环境友好。

在不久的将来，我们预计流动生物催化在学术界和工业界用于合成我们日常需要的化学品的使用会急剧增加。尤其是生物催化反应规模缩小的机会，使得能够以更资源高效的方式以高自由度筛选工艺参数的可持续方法成为可能。此外，流动反应级联的模块化而不是一锅合成是一种特别有吸引力的途径。特别是在制药生产中，我们预计行业对流动生物催化的兴趣会越来越大，因为流动生物催化可以在缩短上市时间方面发挥重要作用。

我们特别关注未来的前景，如3D打印技术、连续运行的反应器中的酶级联和在线分析。此外，连续下游加工的未来发展以及在流动系统中使用非常规介质将为成功和持续的进步做出贡献。

连续流生物催化实例

固定化微生物对 β-酮酯的生物还原

在这个例子中，里约热内卢联邦大学的研究人员展示了一种有趣的替代方法，即通过固定化微生物²生物还原 β-酮酯。

该小组之前曾使用马克斯红酵母和红酵母细胞在批量条件下成功生物还原 β-酮酯，并将条件转移到连续流动方法。通过海藻酸钙截留微生物的固定化使这种类型的系统更加坚固且易于重复使用和回收，这比使用无法回收的全细胞有很大的优势。使用这种方法，该小组以优异的产率和高对映体过量（> 99％）获得了β-羟基酯。通过改变 β-酮酯结构和固定化微生物，还可以控制绝对立体化学。

O-乙酰氰醇的三步伸缩连续法对映选择性制备

在研究化学系在英国剑桥大学，IBG-1：生物技术（德国），和INB（应用科学的亚琛工业大学）已经证明了O型Acetylcyanohydrin的三个步骤的对映准备伸缩连续process³。这是特别有趣的，因为手性精细化学品的生物催化多步方法仍然很少见。

南极念珠菌 CalB 和拟南芥 AtHNL 用于稳健的连续伸缩过程，包括原位 HCN 生成，然后添加醛。在随后的氢氰化反应中观察到高度立体控制。在线化学乙酰化能够稳定新形成的氰醇，并在三个步骤中获得一类具有非常好的转化率和 ee 值的 O-乙酰氰醇（75-99% 转化率；40-98% ee）。

事实证明，该方法在反应时间（40 分钟对 345 分钟）和易于操作方面优于批处理方案，打开了由于安全问题而经常被忽视的反应。模块化组件能够准确控制两个连续的生物转化，安全处理原位产生的有害气体，以及产品的在线稳定性。

用于食品、香精和香料工业的香叶醇酯的合成

这个来自化学工程系（孟买化学技术研究所）的例子展示了香叶醇酯的合成，用于香水、香精和饮料行业⁴。

全球对香精、香水和香精的需求预计每年增长 3.9%，到 2020 年将达到 263 亿美元。商业层面。随着对绿色工艺的需求不断变化，生物催化在该领域的应用已大幅增加。

在这项研究中，采用了固定化南极假丝酵母脂肪酶 B (Novozym 435) 的连续流动填充床反应器。研究了生物催化剂筛选等工艺参数的优化，以及溶剂、摩尔比、温度和酰基供体的影响。使用摩尔比为 1:1 的香叶醇和丙酸，在 70 °C 的 15 分钟停留时间内实现了约 87% 的丙酸香叶酯的最大转化率。发现 Novozym 435 是所有测试中最活跃和最稳定的生物催化剂。

有一个普遍的误解，认为酶不稳定且价格昂贵，只能在高度稀释的情况下工作，并且不能很好地进行可扩展的化学处理。然而，以连续方式进行的生物转化数量不断增加。它们为化学和生化问题提供了许多不同的解决方案，目的是提高复杂反应的选择性和产率。

来源：

https://blog.syrris.com/2018/10/24/the-rise-of-biocatalysis-in-continuous-flow/

The rise of continuous flow biocatalysis – fundamentals, very recent developments and future perspectives

DOI：https://doi.org/10.1039/D0RE00335B

类别：continuous flow biocatalysis,生物催化，连续流动

Other: Combination of chemocatalysis and biocatalysis in flow